一、操作前注意事项
1、D-Luciferin 在 100 mM 的水性缓冲液 (pH 6.1-6.5) 中易于溶解。储备溶液可在不含ATP 的水中制成，并储存在 -20℃ 的温度下，以防光线照射。游离酸必须用适当的碱中和以溶解。在较高的pH 值下，荧光素经历碱催化的脱氢脲醛生成，以及外消旋成 L-异构体。
2、 D-Luciferin 可用于任何现有的报告基因检测或 ATP 检测系统。
3、如果检测 ATP，需要戴手套和使用不含 ATP 的容器，尽量减少所有可能的 ATP 污染源。只使用无菌的不含 ATP 的水和试剂。所有试剂制剂使用蒸压水。
二、实验操作
此说明仅提供实验参考，具体实验方法根据您的具体实验进行更改。
1、体外成像实验示例
①在无菌水中制备 100 mM (100-200X) 荧光素储备溶液 拌匀。立即使用或一次性等份使用，并在-20℃下储存，避免冻融循环，避免暴露在阳光下。
②在预热过的组织培养液中配制 0.5-1 mM D-Luciferin 工作液。
③除去细胞中的培养基。
④在细胞中加入 D-Luciferin 工作液，成像前 37℃ 孵育细胞 5-10 分钟。
2、体内成像实验示例
①在 DPBS 中制备 15 mg/mL 荧光素储备溶液，不含 Mg2+和 Ca2+拌匀。
②过滤器通过 0.2μm 过滤器对溶液进行灭菌。立即使用，或一次性等份使用，并在 -20℃下储存，避免冻融循环，避免暴露在阳光下。
③成像前 10-15 分钟，以 150 mg/kg (或 10 μL/g 荧光素储备溶液) 的动物体重腹腔注射D-Luciferin。
注：应为每个动物模型进行 D-Luciferin 动力学研究，以确定峰值信号时间。
3、基因检测实验示例
①在无菌水中制备 100 mM 荧光素储备溶液。立即使用，或一次性等份使用，并在 -20℃下储存，避免冻融循环，避免暴露在阳光下。
②在 25 mM tricine 缓冲液 (pH 7.8) 中制备含有 3 mM ATP、1 mM DTT 和 15 mM MgSO4 的1 mM D-Luciferin 工作溶液。
③用移液管将 5-10 μL 细胞裂解液移到微孔板中。使用不含裂解物的裂解试剂或缓冲液作为空白对照。
④根据说明，使用荧光素工作溶液为光度计注入底部。
⑤立即注入 200 μL D-Luciferin 工作溶液，结合时间为 10 秒。

使用萤火虫荧光素酶 (Fluc) 作为报告基因和 D-荧光素作为底物的生物发光成像(BLI) 是目前应用最广泛的技术。将总信号强度与 D-荧光素注射后的时间作图，以生成时间-强度曲线。除了峰值信号外，D-荧光素注射后固定时间点 (5、10、15 和 20 分钟) 的信号被确定为峰值信号的替代信号。给定时间- 强度曲线中的信号针对曲线中的峰值信号进行归一化，以表示 D-荧光素注射后的时间变化模式。注入 10 μL 每克体重的 D-萤光素 (腹膜内或静脉内) 储备液：标准 150 mg/kg 注射的20 g 小鼠通常约 200 μL。
解冻 D-萤光素 (钾盐或钠盐) 室温并溶解在 dPBS (不含钙或镁) 中，最终浓度为15 mg/mL。通过5-10 mL 的无菌 H2O 润湿 0.22 μM 过滤器并丢弃水。通过准备好的 0.22 μM 注射器过滤器对D-荧光素溶液进行消毒。
注射入体内 10-20 min (待光信号达到最强稳定平台期)，再进行成像分析。
注意：建议对每只动物模型都需要建立荧光素酶动力学曲线，从而确定最高信号检测时间和信号平台期。荧光素注射注入小鼠体内后，约 1 min 可扩散到小鼠全身。
对于腹腔注射来讲，扩散较慢，开始发光较慢，持续发光时间较长。
对于荧光素的尾部静脉注射，扩散快，开始发光快，但发光持续时间较短。